聖約翰騎士團全稱是「耶路撒冷聖約翰醫院騎士團，成立於1099年，最初是由法國貴族Gerard和幾名同伴在耶路撒冷的施洗者聖約翰教堂附近的醫院裡成立，主要目的施照料傷患和朝聖者。1113年，教廷承認他們是獨立的修會，並賜予他們一系列的經濟、政治特權，如無需繳納十一稅，無需接受任何政權的領導，只受教皇節制。醫院騎士團的會規以聖奧古斯丁修會的會規為基礎制定。騎士團的成員分為教士、騎士和士官，以及會友。騎士團由一位大團長(Grand Master)統治，並有教士會議和八位法官協助。其組織和聖殿騎士團十分相似。
聖約翰騎士團成立時只是一個行善的組織，從1120年才開始作為一個軍事修會進行活動，並發展成為耶路撒冷王國的一支重要的軍事力量，對耶路撒冷的政局也有很大的影響力。它在耶路撒冷王國擁有7座大的要塞，140多座其它建築。耶路撒冷王國國王博度安四世去世後，當時聖約翰騎士團的大團長Roger de Moulins反對居伊(Guido von Lusignan)繼任，可惜沒有成功。後來在1187年哈丁之戰中，醫院騎士團也派出主力參戰，由於指揮上的失誤，包括醫院騎士團、聖殿騎士團在內的基督教軍隊幾乎全軍覆沒，聖約翰騎士團大團長Roger de Moulins戰死。
由於巴勒斯坦的基督教王國被阿拉伯人擊敗，1291年，騎士團放棄了巴勒斯坦，前往塞浦路斯，在那兒沒呆多久，1309年又撤到羅德島。在羅德島，騎士團用海軍阻止了穆斯林向東地中海地區的擴張。當1453年君士坦丁堡落入土耳其人的手裡時，羅德島上的聖約翰騎士團是整個東地中海地區唯一的基督教力量。在羅德島的抵抗一直持續到1522年。那一年，蘇裡曼大帝指揮20萬軍隊乘坐著400艘戰艦來到羅德島，而島上的騎士團只有7000名士兵，雖然實力對比懸殊，但騎士團愣是獨立堅守了6個月，土耳其軍隊至少有5萬人在戰鬥中喪生。最後騎士團與土耳其人達成協議，騎士團撤出羅德島，前往歐洲。
在歐洲的7年時間裡，他們多次遷徙，居無定所。到1530年，奉教皇Clement VIII和神聖羅馬帝國皇帝查理五世的命令，醫院騎士團來到馬耳他島，每年象徵性地向西西里王國繳納1馬耳他鷹幣作為租金，在島上騎士團建立了馬耳他騎士團國(Sovereign Military Order of Malta，縮寫為S.M.O.M)。土耳其人對騎士團的捲土重來顯然很不安，1565年，土耳其人派出大軍進攻馬耳他。這場大戰一開始和上次在羅德島的大戰很相似：騎士團苦苦支撐，絕大多數城市都被摧毀，騎士團成員有一半戰死。就在騎士團眼看要支撐不住時，從西班牙來了一支援軍，戰場局勢頓時扭轉，土耳其軍隊倉惶撤退，損失達到3萬餘人。這次大勝使馬耳他騎士團國獲得了一段時間的和平局面。1571年，土耳其人自以為海軍發展得差不多了，再次起兵，企圖消滅騎士團。不過這次他們敗得更慘：還沒到馬耳他，在海上就遇上了西班牙的無敵艦隊，土耳其艦隊幾乎全被擊沉或俘虜。此後馬耳他騎士團國進入鼎盛時期，帆上標有馬耳他八角十字的戰船在地中海橫行無阻。
騎士團在馬耳他島的統治一直持續到18世紀，1798年6月11日，拿破侖迫使聖約翰騎士團投降，佔領了馬耳他島，島上騎士團的教堂和修道院被法軍洗劫一空。騎士團的大部分成員前往俄羅斯，在那裡，俄羅斯沙皇保羅一世給予他們以庇護，而騎士團則選舉保羅一世為新的騎士團大團長。
離開了馬耳他島之後，騎士團失去了領土，但作為一個組織仍然存在。1834年騎士團在羅馬重建總部，終於再次穩定下來。騎士團的軍事使命已經完結，此後主要從事慈善事業。今天，馬耳他騎士團國仍然是聯合國的會員國，它設在羅馬的總部馬耳他大廈是它唯一的領土--它可能是世界上最小的國家了。
宗教革命後，以德意志為首的新教國家的醫院騎士團從騎士團總部獨立出去，但仍然保持聖約翰騎士團的稱號。信仰天主教的馬耳他騎士團則是醫院騎士團的直接繼承者。
聖約翰騎士團的口號是「守衛信仰，幫助苦難(Defence of the faith and assistance to the suffering)」。聖約翰騎士團最初的標誌是黑底白色的八角十字，到13世紀中期開始則普遍使用紅底白色的八角十字，這種八角十字也因騎士團之名被稱為「馬耳他十字」。
